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双光子显微成像技术应用

近年来,荧光显微镜的市场空间发展较快,双光子显微成像发展更为迅猛,增长速度是整个荧光显微镜的2倍,年复合增长率高达35%。双光子显微镜经过了近30年的发展,经历了逐步改进和完善,衍生出了可以实行多种不同功能的版本,目前商用化的双光子显微镜就有超过10家公司在出售。这种显微镜可以探索活体内众多细胞的复杂动态行为。作为新一代核心技术,它可以阐明各种人类疾病的未知病理生理学,并有望发现新的治疗方法。

● 揭开双光子显微成像“神秘面纱”
 双光子显微成像技术(Two-Photon Imaging)被称为“21世纪的生命科学”,新的成像技术将“还原论”上升到了“整体论”,正常的生命条件下,能够实现在活的生物体内看到细胞和分子活动的过程。
双光子显微成像技术广泛应用在荧光关联谱学、归一极化率、多光子光谱学、三维光学存储,同时涉及钙生物学研究、神经学研究、胚胎学组织学研究、分子生物学研究、细胞分泌研究等。在活细胞动态三维成像有明显的技术优势,可在体外对生物组织进行三维亚微米尺度的研究;同时在临床医学上可以实现实时体内活检,从而更快识别和治疗疾病。
● 双光子荧光显微镜成像技术原理
 
科学研究过程中,生物样品往往没有良好的对比度,导致很难区分相邻结构之间的界线。改善激光扫描显微镜对比度的常用方法是使用荧光。在荧光照明中,使用发光分子将感兴趣的部分与背景或相邻结构区分开来。这种发光分子可以预先存在于样品中(内源性或自体荧光),外涂并附加到样品成分上(化学构成或通过抗体结合),或转染(荧光蛋白)到细胞之中。双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子,在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后,发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。
● 飞秒激光器提供关键光源

双光子激发需要很高的光子密度,为了不损伤细胞,双光子显微镜使用飞秒高能量锁模脉冲激光器。飞秒激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脉冲宽度只有 100 飞秒,而其频率可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时,物镜的焦点处的光子密度是最高的,双光子激发只发生在物镜的焦点上,提高了荧光检测效率。

● 强光激发下同时吸收两个光子
通常情况下,一个荧光分子或者原子每次只能吸收一个光子,当吸收的光子的能量与基态和激发态之间的能级差相匹配时,激发就发生了,这就是单光子吸收。双光子吸收/激发指的是在强光激发下,分子同时吸收两个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。两个光子可以是相同波长的,也可以是不同波长的,但必须是同时吸收(两个光子到达被激发分子的时间间隔小于1飞秒)。双光子激发分子属于三阶非线性光学(NLO)现象,在强度足以与分子内部电场强度相当的激光作用下,才能表现出来。高光密度条件下,两个长波长的光子被荧光分子吸收、激发荧光分子发射出较短波长的光子。也可以理解为分子或原子通过一个虚中间态(寿命只有激发态的约千万分之一)同时吸收两个光子达到激发态。
● 双光子成像技术条件苛刻
要求一:与单光子荧光效应相比,双光子荧光效应的发生概率极小,需要极高峰值功率的飞秒激光作为光源才能得到足够生物成像所需的荧光信号;
要求二:飞秒激光的传输是一个复杂的,非线性光学效应主导的过程。为了保证飞秒激光的无畸变传输,传播介质有着严格的限制;
要求三:在一般的生物样本中,相同平均功率和等效激发波长下,一般双光子所激发的光子数比单光子效应激发的光子数少几个数量级,所以每次需要把全部的激光都汇聚在一个微米量级的点来提高激发效率,所以对光学系统的光学性能要求更加苛刻,并且为了得到二维图像,通常需要通过逐点扫描的方式进行成像。
 
● 亟需解决的关键技术
针对双光子成像自身特点,微型双光子显微镜需要解决如下几个难题:
  • 如何将飞秒激光有效的导入微型显微镜;

  • 如何在微型显微镜内进行扫描/图像重建;

  • 如何在微型显微镜中进行高质量的激光汇聚,高效激发双光子信号;

  • 如何有效的对荧光信号进行收集;

  • 如何使整个系统在生物体剧烈运动时仍保持稳定;

  • 在满足前5项条件下,重量是否足够轻,以致尽量小地对生物体的活动造成影响。

● 双光子荧光显微镜设备优势明显
双光子技术在生物显影、生物荧光探针等方面的优势:

看得深/高组织穿透能力/10倍以上/mm级别,生物体内源分子的双光子吸收截面大都很小,故而能够实现暗场成像,背景干扰很小;由于激发光波长、发射光波长的波长差异大,减小了激发光对发射光检测的干扰,有效减小了检测背景、提高了信噪比。

光损伤小/光漂白和光毒性降到最低/可长时间观测,长波激发,短波发射。长波的红外光不容易被细胞散射,对样品的穿透深度更深,可以用于检测更厚的样品;而且,长波光源对生物体的光损伤也较小。被吸收的长波长光子,其波长为荧光分子单光子激发光波长的两倍。这样对于需要紫外激发光单光子激发的荧光分子,可以由近红外甚至红外光波长范围内的双光子激发。因此双光子技术可以大大减弱活体样品检测中的光毒性。

看得准/高空间分辨能力/分辨率高/可观察断层,双光子激发只在高光密度条件下发生,使用激光聚焦激发,可以使发生较强荧光的区域的体积大小仅为λ的3次方,吸收截面很小,从而可以达到很高的空间分辨率,光漂白区域也很小。
● 脑科学研究成为热点
众所周知,大脑最重要功能之一是对生物体的行为活动进行调控,而反过来,生物体的行为活动也直接反应大脑的工作状态。对大脑神经系统的探究,一方面可以直接解决生命智能有关的问题,例如心理疾病、器质性的神经退行性疾病(如老年痴呆);另一方面,可启发用于人工智能方面的研究。人类1400克的大脑中有百亿数量级的神经元和百万亿数量级的神经突触,为了了解大脑,研究者不仅要求在活体状态下对神经元进行高分辨率观测,而且也希望生物体在被观测的阶段里,能够进行正常的行为活动。所以,在研究生物体自由活动下直接观察大脑结构和活动时,以尽可能小的限制观测对象来获得最接近生理状态下的大脑活动的信息。
基于此,在对成像技术不断地提高分辨率的同时,科研人员也积极改进和革新成像技术手段,直到双光子显微成像技术的应用提供了优化的解决方案。
● 920nm红外飞秒激光
920nm飞秒激光作为激发光源,是脑组织成像中激发绿色荧光蛋白(GFP)的最优波长,920nm双光子显微成像设备在研究脑科学及精确诊断神经系统疾病中,优势突出!目前,国内尚无全光纤化高功率、高可靠性920nm商用飞秒激发光源,进口全光纤化920nm飞秒价格昂贵,几乎占到系统的60%以上。由于研发需求,部分科研机构采用全固态掺钛蓝宝石可调谐激光器作为激发光源,不仅体型庞大、结构复杂,而且后期维护成本很高。所以高功率、便携式920nm飞秒激发光源及双光子显微设备的国产化研制是当前生物医疗事业发展的迫切需求!

 

奥创光子作为超快激光、飞秒激光领域的先行者,已掌握920nm飞秒激发光源研制关键技术——高非线性光纤中四波混频参量转换、被动同步、孤子辐射、光纤参量啁啾脉冲放大等。

如上图,以1560nm激光振荡器为基础,调谐产生中心波长为1.3μm和1.0μm的泵浦光及闲频光,在高非线性光纤中利用四波混频效应产生920nm飞秒激光脉冲。